反相高效液相色谱

定义

反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相构成的液相色谱分离体系，与由极性固定相和弱极性流动相构成的正相色谱在极性强弱搭配上正好相反^[1]。判断一种方法是否属于反相模式，关键看固定相与流动相两者的相对极性，而非某一相的绝对性质^[4]。

它属于化学键合相色谱法的一支。键合相色谱法由液液色谱法发展而来，目的是解决机械吸附在载体上的固定液容易流失的问题，办法是把有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面^[1]。按固定相与流动相相对极性的强弱，键合相色谱法分为正相键合色谱法与反相键合色谱法，后者即反相高效液相色谱^[2]。

在色谱柱选择上，最通用的反相填料是键合十八烷基碳链的硅胶，即C18柱，在药品标准分类中编号为L1；其后是键合八烷基碳链的C8柱、键合苯基的苯基柱以及部分条件下可用于反相模式的氰基柱^[3]。同样标注为C18的色谱柱并非具有完全相同的保留性质，这也是反相方法开发中需要注意的问题^[3]。

原理

样品随流动相进入色谱柱后，各组分在固定相与流动相之间反复进行吸附与解吸，因极性不同而与两相的亲和能力存在差异，最终依次被洗脱分离^[5]。在反相条件下，极性较强的组分更易留在极性流动相中，被较快冲出柱子，保留时间短、出峰靠前；疏水性强的组分更容易与C18非极性链结合，在柱内停留更久，出峰靠后^[5]。因此，化合物在反相柱上大致按极性由高到低的顺序流出，极性越低洗脱越慢^[6]。

对分离机理的主流解释是疏溶剂理论。非极性溶质或分子中的非极性部分进入极性流动相后，会排挤部分溶剂分子；当它被流动相推到固定相附近时，其非极性部分倾向于与非极性固定相上的烃基缔合，以减少与极性溶剂的接触面积，使体系能量降低^[7]。这一过程是可逆的缔合平衡：$\mathrm{S} + \mathrm{L} \rightleftharpoons \mathrm{SL}$，其平衡常数与自由能变化满足 $\ln K = -\dfrac{\Delta G}{RT}$，而保留因子 $k' = \varphi K$，其中 $\varphi$ 为固定相与流动相的体积比^[7]。据此，溶质的保留主要来自溶质与极性溶剂之间的排斥，而非溶质与键合相之间微弱的非极性相互作用^[7]。

流动相组成是控制保留与选择性的主要手段。流动相极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱越快；提高甲醇、乙腈等有机相比例会增强洗脱能力，缩短保留时间，但也可能使色谱峰重叠、分离度下降^[4][5]。洗脱方式分为分离过程中水—有机溶剂比例不变的等强度洗脱，和比例按程序变化以分离宽极性范围组分的梯度洗脱^[3]。对于可电离化合物，保留行为还显著受流动相pH影响：酸性化合物在低pH下保留更强，碱性化合物在高pH下保留更强，中性化合物则基本不受影响^[8]。带电分析物可借助离子对试剂在反相柱上分离，这一技术称为反相离子对色谱^[3]。

发展历程

“反相”一词有其历史背景。20世纪70年代，大多数液相色谱在未修饰的二氧化硅或氧化铝上完成，这些表面呈亲水性，对极性化合物亲和力更强，因而被称为正相色谱；改用烷基链共价键合到载体表面后，洗脱顺序被颠倒过来，反相色谱由此得名^[3]。

早期反相柱采用的固定相是涂覆在硅胶上的非极性液体，属于可用但亚稳的体系；键合相固定相出现后，液相固定相迅速被取代，类似的键合相至今仍是最常用的反相填料^[9]。1973年，沃特世公司推出首款采用单官能硅烷键合的商品化10微米C18色谱柱^[10]。同年前后，研究者开始在实验中使用ODS固定相，探讨疏水相互作用的发生机制；当时缓冲溶液中使用的无封端柱会在数周内丧失保持能力，稳定的封端柱还需数月才得以上市^[11]。

1972年，色谱柱装填技术出现突破，颗粒可悬浮于与硅胶密度相近的溶剂混合物中再泵入柱管，使得粒径小于30微米的填料能够用于填充，10微米颗粒柱成为20世纪70年代的标准^[9]。20世纪80年代，5微米球形颗粒柱迅速取代10微米柱，反相HPLC逐渐成为通用手段，填料微粒化、ODS填料的理解与性能提升同步推进^[9][11]。1996年前后，填料平均粒径进一步减小至2微米以下以提高柱效、缩短分析时间；2004年沃特世推出首台可适用小于2微米颗粒的超高效液相色谱设备，但超细颗粒带来柱入口压力过高的技术难题。作为应对，研究者开发出粒径5微米的核—壳型硅胶颗粒以实现快速分离。

应用

制药是反相高效液相色谱最核心的应用领域，涵盖从研发到质量控制的全流程^[12]。在药物杂质谱分析中，C18固定相配酸性流动相的反相方法被视为通用首选，约九成低分子量药物化合物的分离由反相模式完成；对中性物质可改用五氟苯基固定相，对碱性物质则可用C18配碱性流动相或混合模式色谱^[13]。在药代动力学研究中，该方法可用于获取吸收半衰期、消除半衰期、达峰时间等参数^[1]。

中药与天然产物质量控制是另一个重要方向。中国药典中的沉香特征图谱、三七总皂苷含量测定等项目均采用C18反相色谱柱完成^[14]。研究者也建立了反相高效液相色谱法，以C18柱和磷酸水溶液—乙腈梯度洗脱同时测定人参中人参皂苷F2与Rg3的含量^[15]。

在食品与环境领域，该方法用于食品添加剂、防腐剂、甜味剂、维生素、农药与兽药残留、真菌毒素的检测，以及多环芳烃、酚类化合物、多氯联苯和邻苯二甲酸酯等有机污染物的分析^[12]。例如按国家标准开发的反相方法可在单次进样中分离酱油样品中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精和脱氢乙酸等五种添加剂^[14]。

此外，反相模式也用于生物大分子的分离和纯化。在生物大分子的反相液相色谱中，流动相多采用酸性、低离子强度的水溶液，并加入一定比例与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇作为有机改性剂，大量使用的填料是孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相^[16]。小分子多肽、胰岛素和酶解片段通常以C18柱为标准选择，大分子蛋白则更多采用离子交换或体积排阻模式^[12]。

局限

反相高效液相色谱的传统硅胶基质存在化学稳定性的“窄窗口”。硅胶骨架本质上是水合二氧化硅，pH低于2时硅氧烷键易发生酸催化水解断裂，pH高于8时氢氧根离子会直接侵蚀骨架，引发不可逆溶解和结构坍塌，因此这类色谱柱通常只能在pH 2至8范围内安全使用^[17]。这一限制降低了方法开发的灵活性，尤其在需要用极端pH优化可电离化合物分离选择性时更为明显^[17]。

残留硅醇基带来的次级效应是另一类固有缺陷。由于空间位阻，硅胶表面的硅醇基无法与硅烷试剂完全反应，即经过封端处理，仍约有半数硅醇基保持游离状态。这些呈弱酸性的硅醇基会与碱性分析物发生离子交换作用，造成色谱峰拖尾、保留时间漂移、柱容量下降和重现性变差；用碱性流动相分析碱性化合物时，往往需要加入胺类添加剂来抑制拖尾^[17][9]。

在分离对象上，反相模式更适合疏水性化合物，对极性或带电化合物的保留往往不足，或虽能保留但峰形不佳，使杂质分析困难甚至无法进行^[13]。对于在反相柱上几乎不保留的强极性化合物，需要转用亲水相互作用色谱等其他模式^[18]。此外，反相介质表面疏水性强、流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在分离过程中容易变性失活，以回收生物活性蛋白质为目的时需要谨慎选择反相介质^[4]。

实际操作中也存在若干限制。C18反相柱不宜长时间处于纯水相体系中，否则易造成固定相疏水塌陷，导致柱效降低、分离效果变差^[5]。使用缓冲盐体系检测后不能直接用纯有机相冲洗，需先用纯水充分冲洗管路和色谱柱，再过渡到有机相，以防盐分析出结晶^[5]。梯度洗脱完成后还需预留足够平衡时间，避免后续样品保留时间偏移^[5]。同时，由于反相方法使用甲醇、乙腈等价格较高且有一定毒性的试剂，其应用在一定程度上受到限制，例如可能造成部分蛋白失活，因此该方法在分析鉴定方面的使用多于制备回收^[16]。

参见

• 高效液相色谱 —— 反相高效液相色谱是其中最常用的分离模式，两者是整体与分支的关系。

• 正相色谱 —— 固定相为极性、流动相为非极性，与反相色谱的极性搭配正好相反。

• 化学键合相色谱法 —— 反相高效液相色谱所属的色谱类别，固定相由有机官能团共价键合于载体表面制得。

• 离子对色谱 —— 反相模式的一种改良形式，借助离子对试剂分离可电离化合物。

• 亲水相互作用色谱 —— 用于分离在反相柱上几乎不保留的强极性化合物的替代模式。

• 超高效液相色谱 —— 采用更小粒径填料、在更高压力下运行的高效液相色谱技术，多以反相模式操作。