荧光淬灭原理

定义

淬灭指任何使样品荧光强度降低的过程^[1]。荧光是分子吸收光子后被激发、随后返回基态时释放光子的现象，而淬灭之所以被看作一个双分子过程，是因为激发态分子需要与体系中的其他分子（淬灭剂）相互作用才会失去能量，结果是荧光强度净减少^[1]。随着淬灭剂浓度升高，荧光强度按一定规律下降，这种浓度依赖关系可以定量测量^[1]。

按照分子相互作用的性质，淬灭通常分为碰撞淬灭（动态淬灭）、基态复合物形成（静态淬灭）、共振能量转移和内滤效应等几类^[2]。其中内滤效应严格来说属于测量假象，并不涉及荧光分子自身失活途径的改变^[2]。

原理

荧光团吸收光子跃迁到激发态后，既可以通过发射光子返回基态，也可以通过非辐射途径把能量耗散掉，两条途径彼此竞争^[4]。当淬灭剂存在时，激发态多出一条失活通道，荧光量子产率和荧光强度随之下降^[4]。

graph LR

A[荧光团吸收光子] --> B[跃迁至激发态]

B --> C{是否与淬灭剂作用}

C -->|否| D[发射荧光]

C -->|是| E[非辐射失活、荧光减弱]

动态淬灭又称碰撞淬灭，发生在处于激发态的荧光团与淬灭剂分子相遇之时，激发能转移给淬灭剂或周围介质并以热的形式耗散^[2]。该过程要求两种分子直接接触，其速率常数受溶剂黏度制约^[4]。随着淬灭剂浓度增大，荧光量子产率与荧光寿命同时下降^[4]。这一关系可用 Stern-Volmer方程 表示：$F_0/F = 1 + K_{SV}[Q] = 1 + k_q\tau_0[Q]$，式中 $F_0$、$F$ 分别为加入淬灭剂前后的荧光强度，$K_{SV}$ 为淬灭常数，$k_q$ 为双分子淬灭速率常数，$\tau_0$ 为无淬灭剂时的荧光寿命，$[Q]$ 为淬灭剂浓度^[5]。动态淬灭的淬灭常数一般随温度升高而增大^[6]。

静态淬灭来自荧光团与淬灭剂在基态形成的稳定复合物，该复合物不发光，能够吸收光子的荧光分子比例因而减少，荧光强度降低，而未结合荧光团的荧光寿命基本不变^[4]。由于复合物的吸收光谱往往不同于游离荧光团，吸收光谱的变化可作为判断静态淬灭的依据^[2]。静态淬灭的淬灭常数通常随温度升高而减小^[6]。当动态与静态淬灭同时发生时，淬灭曲线会偏离直线并向上弯曲，需要引入二次项加以修正^[7]。

福斯特共振能量转移是另一条重要途径，受激的给体分子通过偶极—偶极耦合把激发能交给受体分子，无须直接接触，作用距离可达约 100 埃（10 纳米）^[2]，但要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有足够重叠^[4]。激发态电子转移也能造成淬灭，即激发态分子把电子交给受体而失活^[8]。内滤效应则是样品对激发光或发射光的再吸收带来的信号衰减，不改变荧光寿命，也不属于静态或动态淬灭^[6]。荧光团浓度很高时，同种分子之间还会发生自淬灭^[2]。

能够充当淬灭剂的物质种类很多，分子氧、卤素离子、芳香胺和脂肪胺、丙烯酰胺、咪唑、过氧化氢、一氧化氮以及某些二硫化物都可以减弱荧光^[4]。有些淬灭具有明显的分子特异性，例如氯离子是奎宁的典型淬灭剂，嘌呤类化合物能淬灭黄素腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的荧光^[4]。除淬灭剂外，温度、黏度、pH、溶剂极性和氧化还原状态也会改变荧光信号，在处理淬灭数据时需要一并考虑^[4]。

发展历程

对淬灭的定量分析始于 20 世纪初。1919 年，奥托·斯特恩（Otto Stern）与马克斯·沃尔默（Max Volmer）发表关于荧光衰减时间的研究，给出了把荧光强度或寿命变化与淬灭剂浓度联系起来的动力学关系，即后来所称的 Stern-Volmer 方程，到 2019 年该方程已有百年历史^[9]。这一方法使溶液和气相中激发态的淬灭速率常数得以测定，成为分子光化学的基本工具^[10]。

1924 年，弗朗西斯·佩兰（Francis Perrin）提出作用球模型，认为淬灭剂位于以荧光团为中心的一定半径球内时荧光被立即完全淬灭，位于球外则不起作用，该模型可解释高浓度条件下淬灭曲线偏离直线的情形^[7]。

1946 年，西奥多·福斯特（Theodor Förster）提出共振能量转移的经典理论，1948 年又给出相应的量子力学处理，指出非辐射能量转移速率与给体和受体间距的六次方成反比，并引入转移效率为 50% 时的临界距离，即福斯特半径^[11]。按这一理论算出的荧光素临界距离约为 50 埃，与实验结果相符^[12]。

此后，Stern-Volmer 分析被不断推广，用于研究探针与淬灭剂在体系中的分布、缔合、扩散和反应，并与荧光显微成像及时间分辨测量结合，进入单分子和纳米材料研究领域^[10]。

应用

在光学传感器中，传感头表面固定的染料被氧作用后荧光减弱，减弱程度与氧含量成比例，据此可以读出氧气浓度，类似结构也用于二氧化碳检测^[1]。

在核酸检测中，探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，只有当杂交或核酸酶作用使两者分离时报告基团才发出荧光，聚合酶链反应的实时定量分析即依赖这一信号开关^[13]。以碳纳米颗粒等纳米材料作淬灭剂时，单链 DNA 探针通过碱基与材料表面的相互作用贴近淬灭剂而熄灭，与目标序列杂交后脱离表面，荧光随之恢复^[14]。

蛋白质自身的内源荧光也常用于结合研究。色氨酸残基的荧光可被碘离子等淬灭剂减弱，分析淬灭曲线能够判断配体与蛋白质的结合情况并估算结合常数^[1]。同类原理被用于检测硝基芳烃与爆炸物、重金属离子和药物活性成分，荧光探针的种类也扩展到有机染料、配合物和纳米材料等^[1][3]。

在均相荧光免疫分析中，溶液中淬灭剂对抗原或抗体荧光的减弱程度会随抗原—抗体复合物的形成而改变，因而无需分离复合物即可完成测定^[15]。

局限

内滤效应造成的信号下降容易与真正的淬灭混淆，它来自样品对激发光或发射光的再吸收，属于测量假象；为降低其影响，通常建议激发波长处的吸光度不超过 0.1^[2][16]。

仅凭稳态荧光强度往往难以确定淬灭机制。静态淬灭不改变荧光寿命，动态淬灭同时降低强度与寿命，内滤效应也几乎不改变寿命，因此需要时间分辨荧光测量与变温实验相互印证^[8]。当淬灭曲线向上弯曲时，动态与静态淬灭并存、作用球模型、荧光团形成不发光的二聚体等多种情形都能给出类似形态，必须逐一排除^[7]。

淬灭速率常数还受到扩散控制的限制。生物大分子体系中的双分子淬灭速率常数上限约为 $2\times10^{10}$ L·mol⁻¹·s⁻¹，若由实验算得的数值明显超过这一量级，通常提示体系中起作用的是静态淬灭而非单纯的碰撞过程^[17]。

此外，高浓度下荧光团自身会自淬灭，限制了可用的标记浓度；氧和卤素离子等环境中常见的淬灭剂也会干扰测量，使定量结果对实验条件较为敏感^[2][4]。温度、黏度、pH 等的变化同样会改变荧光与淬灭行为，需要在数据处理时加以校正^[4]。

参见

• Stern-Volmer方程 —— 描述淬灭剂浓度与荧光强度、荧光寿命之间定量关系的基础关系式。

• 福斯特共振能量转移 —— 一种无需分子直接接触的长程能量转移过程，也是荧光淬灭的重要途径。

• 内滤效应 —— 样品再吸收激发光或发射光导致的信号衰减，其表现与淬灭相似但机理不同。

• 荧光寿命 —— 激发态分子的平均停留时间，是区分静态淬灭与动态淬灭的关键观测量。

• 荧光探针 —— 以荧光信号变化报告目标分子的分子工具，常以淬灭作为响应机制。