PCR-RFLP是一种把聚合酶链反应(PCR)扩增、限制性内切酶酶切与电泳分离结合起来检测DNA序列差异的技术,其名称来自聚合酶链反应与限制性片段长度多态性两项技术的英文缩写 [1]。由于先扩增目标片段再酶切,它不需要Southern印迹与探针杂交,对样本DNA的用量和质量要求低于传统RFLP,操作也更快、更简便,因而被广泛用于基因分型、遗传病突变检测与病原体鉴定 [2][3]。
定义
PCR-RFLP检测的是特定DNA片段内部的序列差异。其做法是用一对特异引物扩增目标区域,再用限制性内切酶消化扩增产物,电泳分离后依据片段的数目与长度判断样本在该位点上的基因型 [1][4]。检测依据在于:点突变、插入或缺失若使酶的识别序列消失或新生,酶切得到的片段图式就会随之改变;当变异恰好位于识别序列之内时,携带该变异的扩增片段不会被切开,而序列正常者则被切成两段 [4]。
若扩增片段内部共有 $m$ 个该酶的识别位点,完全酶切后可得到 $m+1$ 个片段,各片段长度之和等于扩增片段的总长度。由此产生的条带组合可与个体的基因型一一对应,使该技术成为一种可分辨纯合与杂合状态的DNA标记 [5]。
背景
20世纪70年代中后期出现了以限制性片段长度多态性为基础的标记技术,1980年前后开始投入遗传学研究,是最早一批依据DNA水平差异的分子标记 [2]。其分析路线是把基因组DNA直接交给限制性内切酶消化,电泳分离酶切片段,再经Southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上,与带标记的探针杂交显影,据此读出条带图式 [2]。
这条路线存在若干不便:所需样品DNA较多且质量要求高,实验环节多、周期长、花费偏高,特定探针不易获得,探针标记还常要使用放射性物质 [2][3]。PCR技术成熟后,研究者把扩增步骤引入RFLP分析,先扩增目标片段再做酶切,省去探针制备和分子杂交,检测所需的DNA量明显减少,流程也随之简化 [2]。
内容
PCR-RFLP的操作可归为三个连续环节:用常规PCR扩增目标序列,用相应的限制性内切酶消化扩增产物,再对酶切产物做电泳 [4]。实践中先提取样本DNA,选取合适的引物扩增包含待测位点的片段,随后按酶的最适条件温育完成酶切,最后用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离片段,染色后判读条带 [1][4]。
结果判读取决于两个等位基因在识别位点上的差异。酶切片段长度与数目的组合对应特定基因型:仅出现未切开的全长片段或仅出现切开后的短片段时为纯合,两类片段同时出现时为杂合 [5]。因此PCR-RFLP属于共显性标记,能够把纯合个体与杂合个体区分开,这是它相对于随机扩增多态性等显性标记的一个长处 [6][5]。
如果待测变异本身不落在任何限制酶的识别序列上,可在引物靠近3′端处人为引入错配碱基,使扩增产物中造出一个识别位点,酶切后突变型与野生型的片段长度相差约20至30个碱基对,由此间接判断该位置的碱基种类 [7]。以已知序列设计特异引物、扩增后再用限制酶切来显示多态性的做法,在植物遗传研究中被称为酶切扩增多态性序列;1993年Konieczny与Ausubel在拟南芥的Columbia与Landsberg erecta生态型之间建立了18组此类共显性标记,用于把突变定位到染色体臂上 [6][5]。
影响与争议
PCR-RFLP较早的应用之一是遗传病突变检测。1987年,Chehab等把扩增反应与限制酶消化配合使用,检测镰状细胞贫血和地中海贫血相关突变,使相应的产前诊断能够在数小时内完成 [8]。
在病原体鉴定与分型方面,该技术也被长期使用。以间日疟原虫为例,研究者以环子孢子蛋白基因和裂殖子表面蛋白3α基因片段为靶标,分别用AluI、BstNI、HhaI等酶切扩增产物,依据片段的大小与数目把虫株区分为VK210、VK247等类群,并借此比较同一患者复发前后虫株是否相同 [9]。在动植物研究中,该方法被用于遗传多样性分析、品种与种质鉴定以及分子标记辅助选择等工作 [2][6]。
其分辨能力也经过检验。1990年一项针对HLA II类基因分型的研究指出,按当时条件得到的PCR-RFLP图式不足以唯一确定基因型,在DRB位点的纯合与杂合组合中只有约19%具有唯一性,DQA1、DQB和DPB位点分别为56%、29%和65%,研究者据此认为该方法当时还不适合用于常规分型 [10]。此外,该技术只能检出影响酶切位点的变异,需要预先知道目标序列以便设计引物、挑选合适的酶,一次可分析的位点有限且不易自动化;在疟疾抗药性相关单核苷酸多态性检测等领域,它已逐渐让位于引物延伸、DNA芯片和高分辨率熔解曲线等方法 [7]。
参见
参考资料
- RFLP-PCR . biomart.cn [引用日期2026-09-27]
- openfile . njau.edu.cn [引用日期2026-09-27]
- vol38_no2_rad1(PDF) . org.rs [引用日期2026-09-27]
- PCR-RFLP . uoa.gr [引用日期2026-09-27]
- carrotomics.org 上的网页 . carrotomics.org [引用日期2026-09-27]
- 酶切扩增多态性序列（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS） . biomart.cn [引用日期2026-09-27]
- _b . vet-alfort.fr [引用日期2026-09-27]
- Letters to the Editor . nih.gov [引用日期2026-09-27]
- cdc.gov.tw 上的 PDF 文件 . cdc.gov.tw [引用日期2026-09-27]
- search . ebi.ac.uk [引用日期2026-09-27]
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最近更新：2026-09-27T14:19:42Z
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