荧光淬灭

定义

在实验层面上，荧光淬灭指荧光团与另一分子或基团（即猝灭剂）发生作用后，测得的荧光强度出现下降^[2]。荧光团吸收光子后会在激发态停留一段很短的时间，即激发态寿命，通常为纳秒量级；在此期间发生的相互作用可能使激发态在发光之前就被去活化。猝灭的幅度取决于荧光过程、猝灭过程以及其他失活过程之间的速率竞争，同时取决于猝灭剂浓度，也就是近邻猝灭剂分子的数量^[2]。

按机理，荧光淬灭通常分为动态猝灭与静态猝灭两类：动态猝灭中猝灭剂在激发态存活期间与荧光团接触，为激发态增加了一条失活通道；静态猝灭中猝灭剂在基态就与荧光团结合，生成不发光的复合物^[3]。另外，当猝灭剂的吸收光谱与荧光团的发射光谱发生重叠时，发射出的光会被猝灭剂吸收，这类现象称为内滤效应，属于表观上的信号衰减，一般不被归入严格意义的分子间猝灭^[4][5]。

原理

荧光团吸收光子后由基态跃迁至激发单重态，随后可通过发射荧光、内转换、系间窜越等途径回到基态。猝灭剂的存在相当于为激发态增添了一条无辐射的失活途径，与荧光发射相互竞争，因此荧光强度降低；而荧光量子产率与荧光寿命是否变化，则取决于猝灭的具体类型^[3]。

graph LR

A[基态荧光团] -->|吸收光子| B[激发单重态]

B -->|发射荧光| C[回到基态]

B -->|与猝灭剂碰撞| D[动态猝灭]

A -->|预先形成复合物| E[静态猝灭]

B -->|无辐射能量转移| F[能量转移型猝灭]

动态猝灭来自激发态荧光团与猝灭剂之间的碰撞，碰撞时激发能转移给猝灭剂或周围介质，使荧光团无辐射地失去能量。由于激发态寿命被额外缩短，动态猝灭会同时降低荧光量子产率和荧光寿命；在单纯由碰撞引起猝灭的极限情形下，过程受扩散控制，速率常数与溶剂黏度有关，黏度越低、温度越高则猝灭越强^[3]。对典型的碰撞控制型猝灭，双分子猝灭速率常数约为 1×10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹ 量级^[3]。

静态猝灭发生在基态：猝灭剂与荧光团预先结合，形成不发光的复合物。这类复合物被激发后不发射荧光，相当于减少了能够发光的荧光团比例，荧光强度因而下降，但激发态本身的寿命基本不变^[3]。温度升高会削弱复合物的稳定性，静态猝灭随之减弱，这一温度趋势与动态猝灭正好相反^[6]。

定量描述通常采用 Stern-Volmer 方程：$F_0/F = 1 + K_{SV}[Q] = 1 + k_q \tau_0 [Q]$，其中 $F_0$ 与 $F$ 分别为无猝灭剂和有猝灭剂时的荧光强度，$[Q]$ 为猝灭剂浓度，$\tau_0$ 为无猝灭剂时的荧光寿命，$k_q$ 为双分子猝灭速率常数，$K_{SV}$ 为 Stern-Volmer 猝灭常数^[7]。以 $F_0/F$ 对 $[Q]$ 作图，若只存在单一类型的猝灭，曲线应呈直线；静态与动态猝灭同时起作用时，曲线会出现向上的弯曲^[7]。室温下常规荧光团在溶液中的 $K_{SV}$ 典型值约为 100 L·mol⁻¹^[2]。若实测 $k_q$ 明显超过生物大分子的最大动态猝灭速率常数 2×10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹，一般提示过程以静态猝灭为主^[7]。

除碰撞与基态复合外，能量转移和电子转移也是常见的猝灭机制。在荧光共振能量转移中，激发态供体把能量以非辐射方式传给空间上非常接近的受体，供体自身的荧光被猝灭；转移效率随供体与受体间距离的六次方衰减，有效作用距离约为 1~10 nm，因此可用于测量分子间距离^[8]。光诱导电子转移则多见于开关型荧光探针的设计，也是把识别事件转换为荧光信号的手段之一^[4]。

发展历程

1919 年，奥托·斯特恩与马克斯·沃尔默发表论文，对溶液中发光激发态的猝灭作了动力学分析，给出后来被称为 Stern-Volmer 方程的定量关系，这一工作成为分子光化学研究的重要基础^[9]。该方程最初用于把光致发光强度或激发态寿命的相对变化与猝灭剂浓度联系起来，据此获得猝灭速率常数和判断猝灭机理^[10]。

1924 年，谢尔盖·瓦维洛夫引入荧光量子产率的概念，为衡量猝灭程度提供了基本参量^[11]。1948 年，特奥多尔·福斯特对共振能量转移作出理论处理，解释了相距较远的两个荧光团之间以无辐射方式传递能量并导致荧光减弱的现象^[12]。

此后，Stern-Volmer 方法被不断扩展：既有针对扩散影响、非线性曲线和混合猝灭的理论处理，也被用于荧光显微成像与单分子检测等新场景，由最初的一条直线作图发展出多维的猝灭图谱^[9]。2019 年，相关综述回顾了该方程发表一百年来在电子光谱学与动力学研究中的作用^[9]。

应用

分子氧是最常见的动态猝灭剂之一，其基态为三重态，可以接受较高的跃迁能量而被激发生成单重态氧，从而把发光分子的激发态能量带走^[13]。基于这一原理可以制作溶解氧传感器：把氧敏感染料固定在透氧基质中，荧光强度或寿命随氧浓度升高而下降，经 Stern-Volmer 方程标定后即可换算氧含量。有研究以钌配合物 Ru(dpp)₃²⁺ 为氧敏感染料、以不受氧影响的染料作参比，构成比率式光纤溶解氧传感器，在 0~20.05 mg·L⁻¹ 范围内的 Stern-Volmer 拟合度达 98.22%，响应时间约 12 s^[1]。

在生物分析中，荧光淬灭被广泛用作检测手段。荧光免疫分析利用标记抗原与抗体结合后荧光被猝灭、游离标记物荧光较高的差别，由猝灭程度推算待测物含量^[14]。在核酸传感中，DNA 探针吸附到纳米猝灭剂表面后荧光被强烈猝灭，加入靶标使双链解离并离开表面，荧光信号随之恢复；有研究以生物炭纳米颗粒作猝灭剂，对单链 DNA 的猝灭效率可达 99%^[15]。

蛋白质中色氨酸、酪氨酸残基具有内源荧光，小分子或金属离子与之结合可引起荧光猝灭，据此可研究它们之间的相互作用^[16]。测定不同温度下的 Stern-Volmer 曲线以及双分子猝灭常数，可以判断猝灭类型并估算结合常数与结合位点数^[7]。碳点等荧光探针则可通过配位作用与静态猝灭实现对铁离子的灵敏检测^[17]。

局限

信号减弱并不一定意味着发生了分子水平的猝灭。溶液吸收过强会产生内滤效应，使激发光在光路中被削减；实测数据须作相应校正，常用 $F_{cor} = F_{obs} \times e^{(A_{ex} + A_{em})/2}$ 处理，其中 $A_{ex}$、$A_{em}$ 分别为激发波长和发射波长处的吸光度^[6]。此外，光漂白、光源波动和浓度变化也会改变测得的荧光强度，因此基于强度的测量常需与基于荧光寿命的方法配合使用^[18]。

Stern-Volmer 模型建立在一个简化前提上，即假定所有染料分子对动态猝灭同等可及。该假设对稀溶液近似成立，但当荧光团被固定在固体基质中时，猝灭会受到基质结构以及体相与表面相互作用的影响，实测标定曲线常出现向下的弯曲，需要引入多组分或分布模型才能描述^[13]。

静态猝灭与动态猝灭都随猝灭剂浓度变化，仅凭一条曲线往往难以区分，需要结合变温实验与荧光寿命测量来判断；相关文献也指出，围绕「静态猝灭」「动态猝灭」等术语本身存在并不一致的定义^[19][6]。把猝灭数据用于推算蛋白质与配体的结合常数时，还隐含了荧光团与猝灭剂按一定化学计量结合、体系中只存在单一类别的可及荧光团等条件；当存在多种结合位点或机理混合时，所得结合参数的可靠性会下降^[3]。

参见

• 荧光 —— 荧光淬灭所作用的光物理过程，猝灭导致其强度下降。

• 荧光共振能量转移 —— 常见的无辐射能量转移型猝灭机制，可用作分子间距离的标尺。

• Stern-Volmer方程 —— 描述荧光强度与猝灭剂浓度定量关系的常用模型。

• 荧光寿命 —— 动态猝灭使其缩短、静态猝灭基本不影响，可用于区分猝灭类型。

• 荧光探针 —— 借助荧光淬灭实现对待测物响应的传感材料。

• 溶解氧传感器 —— 基于氧对发光的动态猝灭原理工作的光学传感器。